一、提高热稳定性的谷氨酰胺转氨酶变体

技术简介：

1. 茂源链霉菌来源的谷氨酰胺转氨酶（TGase）能够利用酰胺基转移反应催化蛋白质肽链中谷氨酰胺残基的γ羧酰胺基（供体）与不同的酰基受体生成ε（γglutamyl）异肽键，使蛋白质交联或被小分子修饰。目前，TGase被广泛应用于肉制品加工、乳制品加工以及烘焙等食品加工行业以改变食品品相、口感和稳定性。随着对TGase的研究及应用，发现热稳定性较差是限制其在实际应用尤其是食品领域中的一个主要问题。因此为提高谷氨酰胺转氨酶的热稳定性，采取一系定向进化（全序列的随机突变），半理性设计（饱和突变,基因改组）和理性设计（构建二硫键）的方法被用于其分子改造。其可能是因为较高表面静电荷增加了该突变体与酪蛋白净电斥力，从降低其与后者的亲和力。因此一种热稳定性提高且酪蛋白交联效率也显著提高的谷氨酰胺转氨酶突变体，在工业上具有广泛的应用前景；

2. 为了获得高稳定性和高交联效率的TGase突变体，首先，我们对FRAPDTGm2进行分子动力学模拟确定其柔性区。然后，开发了基于RosettaCartesian_ddg的脚本获得了折叠自由能显著下降的FRAPDTGm2突变体。接着，从上述突变体中筛选和组合得到热稳定性及催化活性均提高的突变体，并评估了最佳突变体的对β酪蛋白的交联活性。此发明所提供的突变型TGase是在母本TGase基础上进行定点突变获得，改造后TGase的60℃半衰期为132.38min，相较于母本的71.9min提升了84％。除此之外，相较于目前报道的稳定性最高的突变体60℃半衰期提高7.6％，并具有显著高于其的酪蛋白交联效率。

适合公司/品牌：

生物领域和食品技术公司/品牌

技术简介：

 1. 硫酸软骨素，是共价连接在蛋白质上形成蛋白聚糖的一类糖胺聚糖。硫酸软骨素广泛分布于动物组织的细胞外基质和细胞表面，糖链由交替的葡萄糖醛酸和N-乙酰半乳糖胺(又称N-乙酰氨基半乳糖)二糖单位组成，通过一个似糖链接区连接到核心蛋白的丝氨酸残基上。其表现出高的生物活性，如抗癌症、抗动脉粥样硬化作用、抗炎、免疫调节、抗氧化等，不仅在细胞转移、分化、增殖、识别以及组织形成等生物过程中起到了重要的作用，还应用于医药及临床。由于硫酸软骨素的分子量大，生物利用度低，在治疗脊柱损伤、轴突再生、抑制肿瘤发生时，硫酸软骨素的很多功效不能得到有效的发挥。在目前商品化的肝素中，由于肝素多从猪小肠中提取得到，在分离纯化的过程中不可避免地混杂着硫酸软骨素杂质，而这会大大影响肝素作为抗凝血药物在临床上的应用与功效。硫酸软骨素ABC裂解酶具有对硫酸软骨素特异性地降解作用而不会引起肝素结构的改变和损失，因此可以用硫酸软骨素ABC裂解酶特异性地消除肝素制备中混杂的硫酸软骨素提高肝素的纯度和品质

2. 为了解决上述问题，此发明提供了热稳定性提高的硫酸软骨素ABC裂解酶突变体。将普通变形杆菌来源的硫酸软骨素ABC裂解酶进行了截短突变，且在截短突变体的基础上做了定点突变，得到了热稳定性明显提高的突变体，得到的突变体在37℃下的半衰期较野生型提高了247倍，将表达突变体的重组菌在3L罐分批发酵蛋白，蛋白表达量可达1.7g/L。为工业化生产硫酸软骨素、硫酸皮肤素提供了新的方法，同时也可以用于在肝素制备中消除混杂的硫酸软骨素。若用获得的新型突变体制备低分子量硫酸软骨素，发现有良好的效果，控制添加的酶量和作用的时间，即可得到不同分子量的硫酸软骨素。

适合公司/品牌：

生物工程技术公司/品牌

技术简介：

1. 茂源链霉菌来源的谷氨酰胺转氨酶（TGase）是一种广泛应用于食品领域的工业酶制剂。它可以催化蛋白及小分子中谷氨酰胺残基的γ羧酰胺基与酰基受体中氨基发生反应促 使二者形成共价交联。目前，TGase在食品中以添加剂形式应用，尤其在食品预处理期间应用频繁，如肉类、豆制品及乳制品加工中进行TGase添加以提升食品品相和口感。TGase的稳定性差一直是限制其应用空间的主要问题。稳定性差致使TGase不易保存、在运输以及使用中损耗均比较大。而在食品加工中，加入TGase后往往伴随着升温以辅 助食品处理，这期间TGase损耗量大则造成成本增高。此外，酶的催化活性，也一直是酶制剂领域的关注热点。因此，挖掘稳定性提升和/或催化活性得到提高的TGase突变体非常重要；

2. 此发明的谷氨酰胺转氨酶变体具有显著改善的热稳定性和比酶活，可以在食品处理、加工和转化等方面进行应用，可以用于保持或改善食品的品质、稠度、弹性、水分或粘度。热稳定性改善的变体更利于其在严苛的工业环境中稳定应用，如人造肉肉糜加工及肉丸加工。此技术中的一个突变体是在序列SEQ ID NO:1上将氨基酸序列第287位突变成脯氨酸；经突变后，该酶的比酶活由初始的25U/mg提升至27.26U/mg，在50℃水浴30min后残余酶活百分比相较野生型提高了186.17％。另外一个突变体是在序列SEQ ID NO:1基础上，氮端与谷氨酰胺转氨酶酶原连接，并同时在SEQ ID NO:1的对应位点发生S2P、S23V、Y24N、S199A、K294L的突变后，再发生A287P突变，该酶的60℃半衰期相较与未做A287P突变的母本2提高了371.56％

适合公司/品牌：

生物领域和食品技术领域企业/品牌

四、可提升2-KLG产量的L-山梨糖脱氢酶突变体

技术简介：

1. 维生素C，又称抗坏血酸，是人体必须的一种维生素。广泛应用于食品、饮料、制药、化妆品和饲料领域。2酮基L古龙酸（2KLG）是生产维生素C的直接前体物质。目前工业生产2KLG利用三菌两步发酵法。和一步发酵相比，三菌两步发酵法具有高能耗、高物耗、混菌发酵难以精确调控和育种困难等劣势。探索一步发酵生产2KLG成为了研究者的共同目标。由于从山梨醇生产2KLG只涉及3个酶的催化过程，分别为D山梨醇脱氢酶、L山梨糖脱氢酶和L山梨酮脱氢酶。因此，目前研究者大多通过代谢工程进行一步菌的研究。主要方法是将2KLG合成途径中关键酶基因进行异源表达进行2KLG的生产，但效果并不能和工业化生产媲美。目前研究表明，L山梨糖脱氢酶可能是2KLG生产过程中的关键限速酶。NCBI比对显示，L山梨糖脱氢酶属于葡萄糖甲醇胆碱氧化还原酶家族。这类酶包含两个结构域，N末端结构域属于辅因子结合域，C末端结构域属于底物结合域。目前针对L山梨糖脱氢酶改造的研究较少，对L山梨糖脱氢酶进行有效的改造，有可能提升2KLG的生产强度；

2. 此发明以氧化葡萄糖酸杆菌来源的L山梨糖脱氢酶为出发序列，通过定点突变获得了可以提升2KLG产量的L山梨糖脱氢酶突变体。通过发酵检测，最终获得的4株突变体的2KLG产量分别为表野生型L山梨糖脱氢酶菌株的1.1、1.4、1.1和1.3倍。

适合公司/品牌：

基因工程和酶工程技术领域公司/品牌

五、可以提高柚皮素产量的查尔酮合成酶突变体

技术简介：

1.  黄酮类化合物(flavonoids)是一类由中央三碳联结两个具有酚羟基苯环的植物次级代谢产物，在植物界广泛存在。该类化合物以C6C3C6结构为基础，根据三碳键(C3)的氧化程度和构象的差别分为以下几类：黄酮、黄酮醇、黄烷酮(二氢黄酮)、黄烷酮醇(二氢黄酮醇)、异黄酮、异黄烷酮(二氢异黄酮)、查耳酮、二氢查耳酮、黄烷、黄烷醇及其他黄酮类等。其在植物体内通常与糖类结合形成配基形式的苷类，少部分以游离态的苷元形式存在。黄酮类化合物不仅在植物的生长发育中起着重要作用，而且还具有抗菌、抗氧化自由基、抗衰老、抗心脑血管疾病、保肝等药理活性。因此，黄酮类化合物的研究一直是国内外生物医药领域研究的热门课题。对于限速酶，提高其拷贝数或者表达量有可能会增加宿主菌代谢负担从而影响菌体的生长和产物的合成。通过定点突变技术提高酶的催化效率可以在不影响菌体生长前提下提高途径效率；

2. 针对现有技术存在的不足，为提高柚皮素的产量，将来源于Sophora japonica的查尔酮合成酶的第61位、208位和308位的氨基酸中的一个或多个进行取代得到的突变体，并进行发酵验证，制备出了可以提高柚皮素产量的查尔酮合成酶突变体，为发酵法高产柚皮素提供了高效酶元件；

3. 此技术以槐米中查尔酮合成酶为出发基因，通过定点突变技术改变查尔酮合成酶氨基酸序列，最终获得12株能提升柚皮素产量的查尔酮合成酶突变体。并通过对表达查尔酮合成酶突变体的菌株进行发酵，柚皮素产量表达分别为野生型查尔酮合成酶菌株的1.41倍、1.24倍、1.44倍、1.28倍、1.30倍、1.10倍、1.17倍、1.09倍、1.11倍、1.05倍、1.23倍和1.23倍。

适合公司/品牌：

基因工程和酶工程技术企业/品牌